7.3. Введение рекомбинантной ДНК в клеткуК настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов. Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам. На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20–30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид. Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (рис. 7.1). Рис. 7.1. Плазмида-вектор с встроенной экзогенной ДНК Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время. Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий. Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. coli , так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами. Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в живой природе. В генной инженерии наиболее широко применяется фаг ?. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК. Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемыу фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены. — 61 —
|