Генетика человека с основами общей генетики

7.1. Выделение генов

Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

Химический синтез генов, т. е. синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответствующей одному гену, впервые был осуществлен в лаборатории Г. Кораны в 1969 г. (Agarwal К. [et al.], 1970). Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п. н. В то время это было выдающееся достижение науки. Еще более значительным событием стал искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК , проведенный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное, он был биологически активен, т. е. работал при введении в клетку.

Уже в 1980-е гг. были успешно синтезированы функционально активные гены инсулина, соматостатина, интерферона . Прогресс в этой области позволил разработать специальные автоматы для синтеза ДНК определенной последовательности.

Получение отдельных генов из молекулы ДНК из природного генетического материала впервые осуществил Дж. Беквит в 1969 г. (Beckwith J., Zipser D., 1970), выделив гены лактозного оперона E. coli.

Главную роль в этом методе играют ферменты рестрикции (разрезания ДНК) – рестриктазы . Такие ферменты синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз , которые делают разрезы в молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах – сайтах рестрикции, которые они способны узнавать. Собственная ДНК организма, продуцирующего рестриктазу, обычно модифицирована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепление. Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований особой ферментативной системой модификации. Ферменты рестрикции и модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от проникновения чужеродного генетического материала и включения его в собственный геном. Структура многих сайтов рестрикции-модификации в настоящее время расшифрована.

Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все потомство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же системой репарации.

К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером (Gilbert W., 1981; Sanger F., 1981) были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence – последовательность). Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.