|
Основной альтернативой методу «блуждающей затравки» было секвенирование «методом дробовика» (шотган-секвенирование), состоявшее в фрагментировании клонов на мелкие участки для последующего секвенирования, а затем выяснении, как эти короткие последовательности снова соединяются вместе. Существовали различные варианты этого метода, отличающиеся тем, как ДНК фрагментировалась на участки. В своей новаторской работе 1982 года по декодированию 48 тысяч пар оснований бактериофага лямбда Фред Сенгер использовал метод дробовика для фрагментирования генома лямбды, хотя и не полностью. Он воспользовался результатами исследования другого нобелевского лауреата, Хэмилтона Смита, который обнаружил фермент рестриктазу – молекулярные ножницы, способные разрезать ДНК на строго определенные участки. Например, рестриктаза ECORI разрезает последовательность GAATTC, но оставляет ее без изменений при замене хотя бы одной буквы в последовательности (например, GATTTC). Разрезая ДНК различными рестриктазами на достаточно малые фрагменты для секвенирования, Сенгер использовал специальную карту ДНК для реконструкции генома лямбды. На карте были видны места на участках ДНК, где действовали ферменты рестрикции. Он использовал их как ориентиры для сопоставления одного участка с другим. Представьте себе, что произойдет, если разрезать номер газеты The New York Times в соответствии с неким правилом, похожим на способ действия рестриктазы. Вырежем часть текста перед словом «сегодня» везде, где на странице встречается предлог «с». Теперь повторим процесс, но с использованием слов «и» и «что». Даже если человек не умеет читать, он знает, что эти слова (сайты рестрикции) по явились на каждой странице газеты в результате вырезания, и сможет восстановить все страниц[23]. Для вирусов метод рестриктазы Сенгера был единственным приемлемым способом секвенирования, но то была ручная, крайне медленная и утомительная работа, и метод этот вряд ли мог быть использован для секвенирования генома бактерий, не говоря уже о трех миллиардах пар оснований генома человека. Работа по секвенированию ДНК успешно продвигалась, как и наши исследования рецепторов. Мы искали эквивалент адреналинового рецептора в одном из самых интенсивно изучаемых организмов в биологии – плодовой мушке Drosophila melanogaster. Мы выделили и секвенировали ген мушки, так называемый «октопаминовый рецептор», явно эволюционный предшественник нашего адреналинового рецептора. У насекомых октопамин выполняет ту же самую функцию «бей или беги», что и адреналин у людей. В те времена я добился уже значительных успехов и меня все чаще приглашали на международные конференции, а также для консультирования биотехнологических и фармацевтических компаний. Но моя исследовательская работа – то, чем я занимался почти два десятка лет со времени появления у Каплана, – подходила к концу. — 105 —
|