|
Кэри Муллис (р. 1944), изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР), говорит, что эта идея пришла ему в голову в 1983 г. во время поездки при лунном свете в горах Калифорнии, где, должно быть, пролегает одна из приятнейших дорог к завоеванию Нобелевской премии. Полимераза, напомним, является ферментом, который помогает копировать нить ДНК, используя ее как шаблон; тот же фермент можно использовать в искусственной среде. Чтобы последнее стало возможным, фермент необходимо обильно снабжать нуклеотидными основаниями и двумя праймерами , представляющими собой короткие последовательности приблизительно из дюжины нуклеотидов; это позволяет реакции продолжаться. Сначала, при нагревании смеси, нити ДНК разделяются (ДНК «плавится»), затем раствор охлаждают, чтобы праймеры могли прикрепиться к соответствующим частям нитей ДНК — молекулы праймеров проталкиваются до тех пор, пока не найдут свое точное дополнение, а затем сцепляются с ним — и действовать как ограничители той части молекулы, которую надо скопировать. В конце температуру снова повышают до значения, при котором полимераза может эффективно функционировать, и на шаблоне растет комплементарная нить. Поскольку фермент должен выдерживать высокие температуры фазы плавления, он экстрагируется из бактерий, таких как Thermus oguaticus , которые живут в горячих источниках. Полный цикл занимает около трех минут. Затем его повторяют снова и снова, от тридцати до сорока раз, постепенно производя десять миллионов копий лоскутков исходной ДНК, лежащих между маркерами праймеров (рис. 2.16). Это означает, что даже из микроскопического образца ДНК нужная область может быть увеличена и сделана пригодной для экспертизы. Рис. 2.16. Последовательность диаграмм, показывающих, как действует полимеразная цепная реакция (ПЦР). Вверху слева мы видим представление двойной спирали ДНК-мишени. На первом шагу (слева ниже) нити разделяются, и к каждой из них прикрепляются праймеры. Ферменты выращивают комплементарную нить по шаблону, предоставляемому каждой из нитей. Сдвоенные нити плавятся снова, и праймеры прикрепляются к каждой из них. Далее ферменты, как и раньше, строят комплементарные версии нитей, но теперь в смеси появляются копии ДНК, лежащие между двумя праймерами и несущие последовательность, повторяющую мишень, и после ряда повторений они начинают доминировать. Сама техника профилирования использует полиморфизм наших генов, тот факт, что молекулы ДНК могут существенно различаться у разных индивидов. Например, мусор в интронах нашей ДНК может содержать длинные последовательности бессмысленной ДНК, накопившиеся во время мейоза. Здесь мы сосредоточимся на изменчивом числе тандемных дупликаций (ИЧТД), как, например, переменное число фрагментов …CGATCGATCGATCGAT… в одной и той же области ДНК, накопленных разными индивидами. Поскольку эти тандемные дупликации лежат в интронных областях, они ничего не означают, и индивид, как и любой наблюдатель, совершенно неосведомлен об их существовании, если только это не вариации эксонов, например, ответственных за карий или голубой цвет глаз (последний является результатом отсутствия коричневого пигмента). — 62 —
|