|
Рестрикционные ферменты. Создание рестрикционных ферментов началось весьма необычно: в опытах с бактериофагами. Бактериофаги (или фаги) представляют собой вирусы, атакующие клетки бактерий, внедряя свои ДНК в клетку-хозяина, который затем плодит данный вирус. Фагов независимо друг от друга открыли в 1917 году бактериологи Фредерик Туорт из Великобритании и Феликс д'Эрелль из Франции. Опыты на бактериофагах получали все больший размах благодаря их возможности убивать опасные для человека бактерии. Однако интерес к ним упал после открытия пенициллина и других химических антибиотиков. Бактериофаги столь многочисленны (по оценкам, их количество составляет 1030), что их общая биомасса значительно превышает общий вес населения Земли. Они почти целиком состоят из белков и ДНК (рис. 4.8). Будучи вирусами, они не могут жить без хозяина. Ввиду простоты своего устройства они оказываются идеальными испытуемыми для получения сведений о жизнедеятельности и их самих, и их хозяев. Хвостовые нити Рис. 4.8. Бактериофаг Хамилтон Смит, микробиолог из университета Джонса Хопкинса[§§] в конце 1960-х работал с Haemophilus influenzae Rd и фагом Р22. Случайно бактерии и фаги стали выращивать вместе. Смит заметил, как активность ДНК у фага все время падала, что указывало на расщепление ДНК фага чем-то внутри бактерии. Смит со своими сотрудниками выделил и очистил ответственный за расщепление фермент и установил его механизм: белковый фермент внутри Н. influenzae расщепляет ДНК фага, выявляя определенную цепь из шести парных оснований и расщепляя ДНК — неизменно в одном и том же месте и одним и тем же способом. Такой фермент получил название рестрикционного. Помимо этого фермента Н. influenzae Rd располагает еще одним ферментом, метилазой, защищающей ДНК бактерии от подобной участи. Фермент метилаза присоединяет метиловую группу к нуклеотидным основаниям цитозина или аденина в ДНК бактерии. Метилирование настолько изменяет молекулу ДНК, чтобы рестрикционный фермент все еще мог распознать место своего подсоединения, не вмешиваясь при этом в обычный ход воспроизводства или метаболизма самой бактерии. С тех пор удалось открыть тысячи ферментов, расщепляющих ДНК на определенных участках. Отрыты были и ферменты, скрепляющие вместе куски ДНК. В итоге всех этих открытий молекулярные биологи располагают ныне набором белковых ферментов, позволяющих им разрезать или склеивать ДНК в заданных местах. Сенгеровский метод обрыва цепи [замещающим нуклеотид] дидезокси[рибонуклеозидтрифосфатом] для секвенирования ДНК. В 1977 году биохимик из Великобритании Фред Сенгер разработал способ расщепления ДНК на участки, соответствующие любой длине исходной ДНК. Этот метод использовал замещающую нуклеотид молекулу. Заместитель не образует связи со следующим нуклеотидом в последовательности, необходимой для создания всей ДНК, так что цепь обрывается на нем. — 55 —
|