|
В Блумингтоне Бенно научился генетическим манипуляциям с Е. coli. Вскоре после прихода в Гарвард он умело применил эти недавно приобретенные навыки, чтобы показать, что лактозный репрессор действительно представляет собой белок, а не молекулу РНК. Используя химические мутагены, он получил почти двести мутантов Е. coli, синтезировавших ?-галактозидазу в отсутствие каких бы то ни было индукторов. У двух из этих двухсот мутация представляла собой изменение исходного кодона на "нонсенс-кодон", что приводило к преждевременной терминации синтеза полипептидной цепочки. Если бы репрессор представлял собой РНК, такого класса мутантов не должно было существовать. Первый черновой вариант рукописи Бенно не открывал всей простоты и изящества поставленного им эксперимента. Сказав ему, что его рукопись написана в тяжелом тевтонском стиле, я переписал ее, и в октябре она была отдана в Journal of Molecular Biology. Как один из редакторов этого журнала, я знал, что она будет быстро опубликована. Хотя и Бенно, и Уолли в своих предшествующих независимых исследованиях не смогли выделить лак-репрессор через его связывание с сильными индукторами ?-галактозидазы, по-прежнему единственный подход у них в распоряжении был основан на этом свойстве peripeccopa. Чтобы увеличить шансы на успех, Бенно вновь обратился к генетике бактерий, получив мутантный репрессор, обладавший повышенным сродством к веществу-индуктору изопропил-(3-0-1-тиогалак-топиранозиду (ИПТГ). Выращивая мутантные клетки Е. coli при очень низких концентрациях ИПТГ, можно было получить намного более эффективный репрессор. Чтобы удвоить количество репрессора в бактериях, Бенно получил из исходного мутанта нового, диплоидного, содержавшего соответствующий ген в двух экземплярах. Однако сами по себе эти генетические уловки еще не позволяли засечь лак-репрессор в бесклеточном экстракте. Успех пришел только благодаря разработке методики разделения веществ, которая давала образцы белков, богатые лак-репрессором. Первые положительные результаты были получены в мае 1966 года, но они были весьма ненадежны. В бактериальных экстрактах, содержащих репрессор, оказывалось лишь на 4% больше помеченного радиоактивной меткой ИПТГ, чем в окружающем, лишенном репрессора растворе. Вскоре более совершенные методы фракционирования позволили получить частично очищенный образец, собиравший ИПТГ в полупроницаемом диализном мешке в концентрации, почти вдвое превышавшей ту, что наблюдалась снаружи. На эти обогащенные экстракты не действовали ферменты, расщепляющие ДНК и РНК. Ферменты протеиназы, расщепляющие белок, напротив, полностью останавливали связывание ИПТГ, подтверждая вывод генетических исследований Бенно, что репрессор представляет собой белок. — 175 —
|