|
Затем фрагменты пропускают через слой геля, на котором молекулы ДНК под действием электрического поля разделяются в зависимости от размера. Теперь можно прочитать последовательность, поскольку более крупным фрагментам ДНК требуется больше времени для прохождения через гель. Поскольку метки на всех четырех нуклеотидах – C, G, A, T – одинаковы и оставляют одинаковый след в виде черных полосок на рентгеновской пленке, необходимо проводить четыре отдельных эксперимента, по одному на каждую букву кода. После использования ДНК-полимеразы для каждого из четырех нуклеотидов-терминаторов (в одной серии опытов помечены все C, в другой – все G, и так далее), их помещают на четыре соседние дорожки на том же самом геле. Когда фрагменты разделяются, одна дорожка демонстрирует фрагменты ДНК, оканчивающиеся на С, другая – оканчивающиеся на G, и так далее. Гель высушивают, выдерживают несколько дней на рентгеновской пленке, оставляя четыре параллельные дорожки с черными полосками, потом внимательно изучают пленку, начиная с первой из четырех дорожек. Так и получают искомую последовательность, записывая по порядку каждую следующую букву сотни раз для каждого образца. Это трудоемкий и длительный процесс, в течение которого могут происходить – и происходят – всяческие сбои. Если одна из четырех реакций на геле не получилась, весь эксперимент идет насмарку; нередко случается, что дорожки располагаются не параллельно друг другу. Это затрудняет сравнивание черных меток и пробелов на каждой из дорожек и считывание всей последовательности. При высыхании гель может растрескаться, и часто именно так и происходит. Реагенты могут разлагаться, и это тоже часто у нас случалось… Меня очень раздражала возможность различной интерпретации результатов – я часто видел, как выводы делались не столько на основании полученных данных, сколько в силу авторитета или в интересах какого-нибудь ученого. Я же хотел получить истинные данные, основанные на эксперименте. Последовательность либо есть, либо ее нет. Она либо точна, в пределах погрешностей метода, либо нет – как правило, в результате неряшливости опыта. После многих недель напряженной работы мы смогли получить клон кДНК для адреналинового рецептора мозга человека. Наше возбуждение достигло предела, когда мы поняли, что эта последовательность значительно отличается от последовательности рецептора индюшки. Мы почувствовали себя на пороге первого большого успеха. — 96 —
|